SC∕T 7221-2016 蛙病毒病检测方法(水产)
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ID： |
29BF9258E46D48CCAE06A71329DC787F |
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文件大小(MB)： |
0.45 |
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页数： |
7 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-12-23 |
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ICS 65.020.30,B 50 ←:才叶,中华人民共和国水产行业标准,SC/T 7221-2016,蛙病毒检测方法,Detection method of ranavirus,2016 -1 2 - 23 发布2017 - 04 - 01 实施,中华人民共和国农业部发布,SC/T 7221-2016,目IJ 1=1,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任,本标准由农业部渔业渔政管理局提出,本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/ TC 156) 归口,本标准起草单位: 北京市水产技术推广站、北京出人境检验检疫局、全国水产技术推广总站、中国检,验检疫科学研究院,本标准主要起草人: 潘勇、张利峰、李清、徐立蒲、江育林、余E忠、张文、曹欢、王小亮、王妹、王静波、,那立海、贾丽,I,SCjT 7221-2016,蛙病毒检测方法,范围,本标准规定了蛙病毒病病原的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、概述、分离、鉴定和综合判定,本标准适用于蛙病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测,2 规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GBj T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,SC/ T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3. 1,蛙病毒ranavirus,虹彩病毒科( lridovirid ae) 蛙病毒属( Ranav iru s) 中除流行性造血器官坏死病毒( Epizootic haemato,poietic necrosis virus , EHNV) 和欧洲姻病毒( European catfish virus , ECV) 外的其他成员,3. 2,蛙病毒病infection with ranavirus,蛙病毒属的多种病毒(不包括流行性造血器官坏死病毒和欧洲细病毒)感染有尾和元尾目动物的一,类系统性临床与亚临床感染,4 试剂和材料,4. 1 蛙病毒参考株: 由农业部指定的水生动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供,4. 2 胖头跟肌肉细胞系(FHM) 、鲤上皮瘤细胞系(EPC) 、大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE) 、蓝媳太阳,鱼细胞系(BF- 2): 采用M199 培养液培养,4. 3 水: 符合GB/ T 6682 中一级水的要求,4. 4 元水乙醇:分析纯，使用前预冷到一20.C ,4.5 dNTP: 含有浓度均为10 mmo l/ L 的dCTP 、dGTP 、dATP 和dTTP ，一20.C 保存,4.6 Taq 酶:1 0 U / μL ， -2 0 .C 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化,4. 7 引物:浓度为10 μmo l/ L 。序列如下:,上游引物F1 : 5'- CGC - AGT - CAA - GGC - CTT - GA T - GT - 3' ;,下游引物R1 :5 '- AAA - GAC- CCG - TTT- TGC- AGC- AAA - C- 3' ;,扩增蛙病毒主要衣壳蛋白基因中5 85 bp 的片段,4. 8 MgClz : 25 mmol/ L ,4. 9 琼脂糖:电泳纯,4. 10 矿物油:要求元DNA 酶和RNA 酶,1,SC/ T 7221-2016,5 仪器和设备,5. 1 解剖盘、剪刀、慑子、组织研磨器,5. 2 倒置显微镜,5. 3 生化培养箱,5. 4 普通冰箱、超低温冰箱,5. 5 低温离心机,5. 6 超净台,5. 7 PCR 扩增仪,5. 8 电泳仪,5. 9 凝胶成像系统或紫外,5. 10 移液器、枪头、离,6 蛙病毒概述,病毒属CRanavir,欧洲细病毒( Eu,直径150 nm~,均能复制,等，并且,7. 1 采样,长为30 mm ~ 6 0,和内脏,7. 2 样晶处理,应在10 0( 以,r/ min 离心2 0 min ，收集上,7. 3 病毒接种与观察,对上清液10 倍稀释两次，然,id ovi rid ae) 蛙, E H NV) 和,病毒粒子,细胞质中,tlgnnum,s , STRV),000 IU/ mL 青霉,孵育过夜。8 000,释度的上清液接种到生长约,24 h 的96 孔板里的FHM 、EPC 、C H SE 坑DI 由JL接种1 00μL 稀释液。22 0( 吸附1 h,后，加入细胞维持液， 于22 0( ~250( 培养。分别设置2 孔阳性对照(接种参考株)和空白对照(未接种病,毒的细胞) ,对照和待测样品接种细胞7d 内，每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应生长正常。被检样品,细胞培养中出现CPE 时，应立即进行鉴定;如果只有阳性对照出现CPE ，被检样品细胞培养中未出现,CPE 时，培养7 d 后盲传一次，出现CPE 进行鉴定，仍未出现CPE.*iJ为阴性,如果阳性对照细胞也未出现CPE ，需要重新进行病毒学检查,8 病毒的鉴定,8. 1 样品处理,SC/T 7221-2016,收集出现CPE 的细胞病变悬液450 μL ，加人1. 5 mL 的离心管， 再加人450μ L CTAB 溶液(见,A. 3) 并混匀。25 0C 处理2 h ~2 . 5 h ,8.2 DNA 抽提,在含有样品的离心管中加入600μL 抽提液2( 见A. 5) ，混合均匀至少30 S o 12 000 r/ m……
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